Kamil Nowakowski
Metody analizy zawartości białka w odżywkach
Prof. dr hab. inż. Stanisław Mleko
Odżywki białkowe kupujemy chcąc zwiększyć dzienne spożycie białka. Istnieją rozbieżności co do optymalnego zapotrzebowania organizmu na białko. Przede wszystkim należy zaznaczyć, iż mówiąc o ilości gramów na kilogram masy ciała należy odnosić się do masy beztłuszczowej lub powiedzmy w czasie „rzeźby”. Istnieją ogólne zasady dotyczące optymalnej i bezpiecznej ilości białka, jednakże prawdziwe zapotrzebowanie zależy od metabolizmu, stylu życia, intensywności treningów, spożywania substancji wspomagających metabolizm oraz indywidualnej zdolności organizmu do wykorzystania białka.
Wzrost aktywności fizycznej zawsze powoduje wzrost zapotrzebowania na białko. Podczas długotrwałego wysiłku następuje katabolizm aminokwasów rozgałęzionych (BCAA). Katabolizmowi ulega izoleucyna, walina, a w szczególności leucyna. Nie biorą one wówczas udziału w procesie syntezy nowych białek mięśni.
Według Światowej Organizacji Zdrowia dzienne zapotrzebowanie dorosłego człowieka na białko wynosi 0,83 g na kilogram masy ciała. Wiemy z literatury kulturystycznej iż zawodowi kulturyści spożywają dziennie nawet po 4 g białka na kilogram masy ciała. Trzeba jednak pamiętać o tym, że stosują oni sterydy anaboliczne, które w ogromnym stopniu „podkręcają” obieg azotu w organizmie. Czasami kulturyści trenujący „na sucho” zastanawiają się dlaczego nie mogą odtłuścić mięśni spożywając małą ilość węglowodanów przy ogromnej ilości białka. Należy pamiętać, iż białko które nie zostało zużyte na cele budulcowe tkanki mięśniowej staje się po prostu źródłem energii o energetyczności około 4 kcal/gram.
Aby firma umieściła na opakowaniu wiarygodną informację dotyczącą zawartości białka w swoim produkcie, wcześniej musi on być przeanalizowany. Jedną z najstarszych metod analizy na zawartość białka jest tzw. metoda Kjeldahl’a. ( niestety nie jest to dokładna metoda ) Zasada tej metody jest bardzo prosta. Każde białko zawiera określoną ilość azotu. Wystarczy więc cały azot w białku przekształcić w amoniak i określić jego stężenie. Niedokładność tej metody polega na tym, że przeliczając azot na białko używa się współczynników, które wynikają ze średniej zawartości azotu w danym rodzaju białka. Dla poszczególnych preparatów różnice mogą wynosić kilka procent. Dla białek mleka współczynnik przeliczenia zawartości azotu na białko wynosi 6,38; dla
albuminy jaja kurzego, białek mięsa, białka kukurydzy i sorga - 6,25; dla białka ryżu - 5,95; dla białek glutenu - 5,70, dla białek orzeszków ziemnych - 5,46.
Inną metodą stosowaną do określania zawartości białka w odżywkach jest chromatografia cieczowa. Odżywka w formie roztworu jest wstrzykiwana na kolumnę wypełnioną odpowiednią fazą stałą. Ciecz jest przetłaczana przez kolumnę pod wysokim ciśnieniem. Szybkość przechodzenia różnych substancji w odżywce przez kolumnę zależy od budowy cząsteczek tej substancji. Przepuszczając wcześniej substancje wzorcowe (na przykład białka) określamy czasy potrzebne do przejścia przez kolumnę i porównujemy z czasami otrzymanymi dla badanych odżywek. Metody chromatograficzne są cały czas udoskonalane. Kiedyś określano z jaką substancją mamy do czynienia tylko na podstawie czasu jej przejścia. Oczywiście kilka substancji może mieć podobny czas przejścia, jak również pochodne chemiczne tej samej substancji mogą mieć (i zazwyczaj mają) różne czasy przejścia. Tak więc w celu dokładnego określenia z jaką substancją mamy do czynienia, chromatografię stosuje się tylko jako metodę rozdziału, natomiast identyfikację przeprowadza się po wyjściu z kolumny przy użyciu coraz to doskonalszych detektorów.
Można na przykład określać dokładnie masę cząsteczkową otrzymanych substancji. Można również odbierać poszczególne frakcje i analizować je na przeróżne sposoby łącznie z dokładnym określeniem budowy cząsteczek.
Coraz częściej stosuje się do analizy białek tzw. elektroforezę. Technika ta oparta jest na rozdziale cząsteczek białek w zależności od ich wielkości i ładunku. Próbki umieszcza się na płytkach lub w kapilarach i „rozwija” przy użyciu prądu elektrycznego. Cząsteczki białek wędrują przyciągane przez elektrodę. Metoda ta wymaga szerokiej wiedzy na temat białek, gdyż łatwo jest pomylić się jeżeli chodzi o ich identyfikację. Na przykład podstawowe białko serwatkowe:(beta) -laktoglobulina w normalnych (natywnych) warunkach występuje w formie dimerów, a więc dwóch połączonych ze sobą cząsteczek. Będzie więc posiadać dwa razy większą masę cząsteczkową niż wynika to z danych literaturowych. Dopiero używając elektroforezy w tzw. warunkach denaturujących możemy dokonać rozdziału poszczególnych białek. Inny problem dotyczący analizy białek to analiza hydrolizatów. W zależności od stopnia hydrolizy możemy mieć do czynienia z całą gamą mas cząsteczkowych
polipeptydów powstałych po hydrolizie białek. Łatwo jest wtedy oskarżyć producenta, iż jego odżywka zawiera dodatek mniej wartościowych składników, gdyż w odżywce występują różne polipeptydy a nie tylko charakterystyczne „podręcznikowe”, „wikipediowe” białka.
Często na opakowaniach odżywek białkowych spotykamy się z podaną zawartością poszczególnych aminokwasów. Aby określić taką zawartość w sposób klasyczny, białka wcześniej muszą być zhydrolizowane. W dzisiejszych czasach nikt nie bawi się w hydrolizę w naczyniach laboratoryjnych i żmudne analizy w celu wykrycia zawartości poszczególnych aminokwasów. Istnieje wiele analizatorów aminokwasów. Roztwór białka wlewa się do analizatora i po stosunkowo krótkim czasie otrzymuje się wynik. Należy pamiętać, że poszczególne metody hydrolizy białek mogą rozkładać niektóre aminokwasy (na przykład hydroliza kwasowa rozkłada tryptofan, kwas asparaginowy i glutaminę oraz częściowo cysteinę). W celu identyfikacji poszczególnych aminokwasów stosuje się również tzw. chromatografię gazową. Aminokwasy w stanie naturalnym nie są lotne i muszą przed umieszczeniem w kolumnie przejść procedurę otrzymywania ich pochodnych. Najczęściej w tym celu wykorzystuje się estry aminokwasów.
Oczywiście należy pamiętać, iż odżywki białkowe są produkowane na bazie izolatów i koncentratów, a te powstają z naturalnego surowca (na przykład serwatki) i skład aminokwasowy może czasami odbiegać od tego jaki jest podany na opakowaniu. Producent najczęściej raz na jakiś czas określa średni skład aminokwasowy i taki podaje na opakowaniu. Podawanie składu aminokwasowego odżywki, czyli tzw. aminogram jest na dzień dzisiejszy stosunkowo prostą i dokładną metodą określania jakości i ilości białka. Należy bowiem pamiętać, iż nie tylko ilość białka jest ważna, ale również jego jakość przejawiająca się w składzie aminokwasowym, a szczególnie w zawartości aminokwasów egzogennych.
Naukowcy cały czas pracują nad nowymi metodami szybkiej i precyzyjnej analizy składu białkowego. Ostatnio zwrócono uwagę na tzw. spektroskopię terahercową. Laser impulsowy emituje promieniowanie o długości fali około 780 nm, o czasie trwania jednego impulsu rzędu 100 femtosekund (jedna femtosekunda to jedna biliardowa części sekundy, czyli 10-15). Fale terahercowe charakteryzują się
bardzo niską energią i są około milion razy słabsze niż fale rentgenowskie. Nie powodują wobec tego fotojonizacji cząsteczek i przy ich użyciu nie dochodzi od zmian konformacyjnych. Można wobec tego określać subtelne różnice pomiędzy poszczególnymi substancjami. Urządzenie analizuje widma związków chemicznych powstające z charakterystycznych przejść wibracyjnych i rotacyjnych cząsteczek. W porównaniu do innych metod spektroskopowych, spektroskopia terahercowa określa drgania całych cząsteczek czy ewentualnie grup atomów. Opracowano swoiste mapy widm dla poszczególnych substancji chemicznych. Jest to coraz szerzej stosowana metoda do wykrywania wszelkich substancji w przemyśle farmaceutycznym czy chemicznym. Naukowcy zgłaszają coraz to nowe widma takich substancji chemicznych jak: aminokwasy, cukry, białka nukleotydy czy cząsteczki DNA. Pracuje się nad aplikacjami przemysłowymi. Powstała pierwsza praca naukowa nad wykorzystaniem tej metody do analizy aminokwasów w odżywkach białkowych. Analizowano stężenia pięciu aminokwasów w dostępnych na rynku japońskim suplementów aminokwasowych i określono ich zawartość. Ciekawostką był fakt, iż analizy tej dokonywano wewnątrz opakowania. Fale terahercowe mają bowiem zdolność przechodzenia przez wiele rodzajów opakowań i w dalszym ciągu analizowania składu aminokwasowego odżywek. Okazało się, że dla odżywek opakowanych i nieopakowanych otrzymano prawie takie same wyniki analizy składu aminokwasowego.
Należy zwrócić uwagę na to, czy producent podaje na opakowaniu zawartość białka w odżywce, czy w suchej masie odżywki. Odżywki zawsze zawierają pewną ilość wody, gdyż nie da się wysuszyć jej całkowicie bez zmian fizykochemicznych, a poza tym są higroskopijne, czyli chłoną parę wodną z powietrza. Ilość wody zależy między innymi od składu odżywki i może wynosić kilka procent, nawet do 10-ciu. Należy również zwrócić uwagę na te odżywki, gdzie producent nie podaje zawartości w procentach, tylko ilość białka w gramach w jednej miarce, którą umieszcza w środku opakowania. Czasami producent robi to aby pomóc w szybkim odmierzaniu
odpowiedniej porcji białka, ale czasami ma to na celu zatajenie faktycznej zawartości białka. Konsument musi wtedy sam obliczyć zawartość białka, co przy braku podanej masy jednej pełnej miarki odżywki nie jest takie proste. Należy wówczas samemu odmierzyć pełną miarkę odżywki i zważyć ją. Następnie użyć wzoru: ilość białka w jednej miarce x 100/masa odżywki w jednej miarce.
Najlepiej jeżeli producent umieści na opakowaniu zarówno zawartość białka w odżywce w procentach, jak i masę białka zawartą w jednej miarce.
Prof. dr hab. inż. Stanisław Mleko
Odżywki białkowe kupujemy chcąc zwiększyć dzienne spożycie białka. Istnieją rozbieżności co do optymalnego zapotrzebowania organizmu na białko. Przede wszystkim należy zaznaczyć, iż mówiąc o ilości gramów na kilogram masy ciała należy odnosić się do masy beztłuszczowej lub powiedzmy w czasie „rzeźby”. Istnieją ogólne zasady dotyczące optymalnej i bezpiecznej ilości białka, jednakże prawdziwe zapotrzebowanie zależy od metabolizmu, stylu życia, intensywności treningów, spożywania substancji wspomagających metabolizm oraz indywidualnej zdolności organizmu do wykorzystania białka.
Wzrost aktywności fizycznej zawsze powoduje wzrost zapotrzebowania na białko. Podczas długotrwałego wysiłku następuje katabolizm aminokwasów rozgałęzionych (BCAA). Katabolizmowi ulega izoleucyna, walina, a w szczególności leucyna. Nie biorą one wówczas udziału w procesie syntezy nowych białek mięśni.
Według Światowej Organizacji Zdrowia dzienne zapotrzebowanie dorosłego człowieka na białko wynosi 0,83 g na kilogram masy ciała. Wiemy z literatury kulturystycznej iż zawodowi kulturyści spożywają dziennie nawet po 4 g białka na kilogram masy ciała. Trzeba jednak pamiętać o tym, że stosują oni sterydy anaboliczne, które w ogromnym stopniu „podkręcają” obieg azotu w organizmie. Czasami kulturyści trenujący „na sucho” zastanawiają się dlaczego nie mogą odtłuścić mięśni spożywając małą ilość węglowodanów przy ogromnej ilości białka. Należy pamiętać, iż białko które nie zostało zużyte na cele budulcowe tkanki mięśniowej staje się po prostu źródłem energii o energetyczności około 4 kcal/gram.
Aby firma umieściła na opakowaniu wiarygodną informację dotyczącą zawartości białka w swoim produkcie, wcześniej musi on być przeanalizowany. Jedną z najstarszych metod analizy na zawartość białka jest tzw. metoda Kjeldahl’a. ( niestety nie jest to dokładna metoda ) Zasada tej metody jest bardzo prosta. Każde białko zawiera określoną ilość azotu. Wystarczy więc cały azot w białku przekształcić w amoniak i określić jego stężenie. Niedokładność tej metody polega na tym, że przeliczając azot na białko używa się współczynników, które wynikają ze średniej zawartości azotu w danym rodzaju białka. Dla poszczególnych preparatów różnice mogą wynosić kilka procent. Dla białek mleka współczynnik przeliczenia zawartości azotu na białko wynosi 6,38; dla
albuminy jaja kurzego, białek mięsa, białka kukurydzy i sorga - 6,25; dla białka ryżu - 5,95; dla białek glutenu - 5,70, dla białek orzeszków ziemnych - 5,46.
Inną metodą stosowaną do określania zawartości białka w odżywkach jest chromatografia cieczowa. Odżywka w formie roztworu jest wstrzykiwana na kolumnę wypełnioną odpowiednią fazą stałą. Ciecz jest przetłaczana przez kolumnę pod wysokim ciśnieniem. Szybkość przechodzenia różnych substancji w odżywce przez kolumnę zależy od budowy cząsteczek tej substancji. Przepuszczając wcześniej substancje wzorcowe (na przykład białka) określamy czasy potrzebne do przejścia przez kolumnę i porównujemy z czasami otrzymanymi dla badanych odżywek. Metody chromatograficzne są cały czas udoskonalane. Kiedyś określano z jaką substancją mamy do czynienia tylko na podstawie czasu jej przejścia. Oczywiście kilka substancji może mieć podobny czas przejścia, jak również pochodne chemiczne tej samej substancji mogą mieć (i zazwyczaj mają) różne czasy przejścia. Tak więc w celu dokładnego określenia z jaką substancją mamy do czynienia, chromatografię stosuje się tylko jako metodę rozdziału, natomiast identyfikację przeprowadza się po wyjściu z kolumny przy użyciu coraz to doskonalszych detektorów.
Można na przykład określać dokładnie masę cząsteczkową otrzymanych substancji. Można również odbierać poszczególne frakcje i analizować je na przeróżne sposoby łącznie z dokładnym określeniem budowy cząsteczek.
Coraz częściej stosuje się do analizy białek tzw. elektroforezę. Technika ta oparta jest na rozdziale cząsteczek białek w zależności od ich wielkości i ładunku. Próbki umieszcza się na płytkach lub w kapilarach i „rozwija” przy użyciu prądu elektrycznego. Cząsteczki białek wędrują przyciągane przez elektrodę. Metoda ta wymaga szerokiej wiedzy na temat białek, gdyż łatwo jest pomylić się jeżeli chodzi o ich identyfikację. Na przykład podstawowe białko serwatkowe:(beta) -laktoglobulina w normalnych (natywnych) warunkach występuje w formie dimerów, a więc dwóch połączonych ze sobą cząsteczek. Będzie więc posiadać dwa razy większą masę cząsteczkową niż wynika to z danych literaturowych. Dopiero używając elektroforezy w tzw. warunkach denaturujących możemy dokonać rozdziału poszczególnych białek. Inny problem dotyczący analizy białek to analiza hydrolizatów. W zależności od stopnia hydrolizy możemy mieć do czynienia z całą gamą mas cząsteczkowych
polipeptydów powstałych po hydrolizie białek. Łatwo jest wtedy oskarżyć producenta, iż jego odżywka zawiera dodatek mniej wartościowych składników, gdyż w odżywce występują różne polipeptydy a nie tylko charakterystyczne „podręcznikowe”, „wikipediowe” białka.
Często na opakowaniach odżywek białkowych spotykamy się z podaną zawartością poszczególnych aminokwasów. Aby określić taką zawartość w sposób klasyczny, białka wcześniej muszą być zhydrolizowane. W dzisiejszych czasach nikt nie bawi się w hydrolizę w naczyniach laboratoryjnych i żmudne analizy w celu wykrycia zawartości poszczególnych aminokwasów. Istnieje wiele analizatorów aminokwasów. Roztwór białka wlewa się do analizatora i po stosunkowo krótkim czasie otrzymuje się wynik. Należy pamiętać, że poszczególne metody hydrolizy białek mogą rozkładać niektóre aminokwasy (na przykład hydroliza kwasowa rozkłada tryptofan, kwas asparaginowy i glutaminę oraz częściowo cysteinę). W celu identyfikacji poszczególnych aminokwasów stosuje się również tzw. chromatografię gazową. Aminokwasy w stanie naturalnym nie są lotne i muszą przed umieszczeniem w kolumnie przejść procedurę otrzymywania ich pochodnych. Najczęściej w tym celu wykorzystuje się estry aminokwasów.
Oczywiście należy pamiętać, iż odżywki białkowe są produkowane na bazie izolatów i koncentratów, a te powstają z naturalnego surowca (na przykład serwatki) i skład aminokwasowy może czasami odbiegać od tego jaki jest podany na opakowaniu. Producent najczęściej raz na jakiś czas określa średni skład aminokwasowy i taki podaje na opakowaniu. Podawanie składu aminokwasowego odżywki, czyli tzw. aminogram jest na dzień dzisiejszy stosunkowo prostą i dokładną metodą określania jakości i ilości białka. Należy bowiem pamiętać, iż nie tylko ilość białka jest ważna, ale również jego jakość przejawiająca się w składzie aminokwasowym, a szczególnie w zawartości aminokwasów egzogennych.
Naukowcy cały czas pracują nad nowymi metodami szybkiej i precyzyjnej analizy składu białkowego. Ostatnio zwrócono uwagę na tzw. spektroskopię terahercową. Laser impulsowy emituje promieniowanie o długości fali około 780 nm, o czasie trwania jednego impulsu rzędu 100 femtosekund (jedna femtosekunda to jedna biliardowa części sekundy, czyli 10-15). Fale terahercowe charakteryzują się
bardzo niską energią i są około milion razy słabsze niż fale rentgenowskie. Nie powodują wobec tego fotojonizacji cząsteczek i przy ich użyciu nie dochodzi od zmian konformacyjnych. Można wobec tego określać subtelne różnice pomiędzy poszczególnymi substancjami. Urządzenie analizuje widma związków chemicznych powstające z charakterystycznych przejść wibracyjnych i rotacyjnych cząsteczek. W porównaniu do innych metod spektroskopowych, spektroskopia terahercowa określa drgania całych cząsteczek czy ewentualnie grup atomów. Opracowano swoiste mapy widm dla poszczególnych substancji chemicznych. Jest to coraz szerzej stosowana metoda do wykrywania wszelkich substancji w przemyśle farmaceutycznym czy chemicznym. Naukowcy zgłaszają coraz to nowe widma takich substancji chemicznych jak: aminokwasy, cukry, białka nukleotydy czy cząsteczki DNA. Pracuje się nad aplikacjami przemysłowymi. Powstała pierwsza praca naukowa nad wykorzystaniem tej metody do analizy aminokwasów w odżywkach białkowych. Analizowano stężenia pięciu aminokwasów w dostępnych na rynku japońskim suplementów aminokwasowych i określono ich zawartość. Ciekawostką był fakt, iż analizy tej dokonywano wewnątrz opakowania. Fale terahercowe mają bowiem zdolność przechodzenia przez wiele rodzajów opakowań i w dalszym ciągu analizowania składu aminokwasowego odżywek. Okazało się, że dla odżywek opakowanych i nieopakowanych otrzymano prawie takie same wyniki analizy składu aminokwasowego.
Należy zwrócić uwagę na to, czy producent podaje na opakowaniu zawartość białka w odżywce, czy w suchej masie odżywki. Odżywki zawsze zawierają pewną ilość wody, gdyż nie da się wysuszyć jej całkowicie bez zmian fizykochemicznych, a poza tym są higroskopijne, czyli chłoną parę wodną z powietrza. Ilość wody zależy między innymi od składu odżywki i może wynosić kilka procent, nawet do 10-ciu. Należy również zwrócić uwagę na te odżywki, gdzie producent nie podaje zawartości w procentach, tylko ilość białka w gramach w jednej miarce, którą umieszcza w środku opakowania. Czasami producent robi to aby pomóc w szybkim odmierzaniu
odpowiedniej porcji białka, ale czasami ma to na celu zatajenie faktycznej zawartości białka. Konsument musi wtedy sam obliczyć zawartość białka, co przy braku podanej masy jednej pełnej miarki odżywki nie jest takie proste. Należy wówczas samemu odmierzyć pełną miarkę odżywki i zważyć ją. Następnie użyć wzoru: ilość białka w jednej miarce x 100/masa odżywki w jednej miarce.
Najlepiej jeżeli producent umieści na opakowaniu zarówno zawartość białka w odżywce w procentach, jak i masę białka zawartą w jednej miarce.
Krzysztof Piekarz
